VIAGGIO NEL DNA DELLE ORGANIZZAZIONI

Il processo di clonazione del DNA(r)

Ideata da Kary Mullis nella metà degli anni '80, la "reazione a catena della polimerasi" (PCR, "polymerase chain reaction") ha rivoluzionato la Biologia molecolare aprendo nuovi orizzonti allo studio del DNA che ricordiamo è la molecola che custodisce l'informazione genetica di ciascun individuo.

 Secondo il modello proposto da James Watson e Francis Crick nel 1953, il DNA ha una struttura a doppio filamento, ciascuno dei quali costituito da una sequenza di nucleotidi.

Per replicare il suo genoma, la cellula dispone di un "macchinario" che provvede a denaturare il DNA, ossia ad aprire la doppia elica, rendendola disponibile affinchè l'enzima DNA polimerasi utilizzi ciascun filamento come stampo copiandolo in un nuovo filamento complementare. Tale sintesi viene innescata da brevi regioni a doppia elica create dalla "primasi" un altro componente enzimatico del "macchinario" per la replicazione del DNA.     

  La PCR imita il naturale processo di replicazione del DNA. In laboratorio è infatti possibile ottenere stampi di DNA a singolo filamento semplicemente riscaldando il DNA a temperatura prossima a quella di ebollizione dell'acqua. L'innesco per la replicazione può essere fornito da un corto frammento di DNA (definito primer) in grado di appaiarsi a una breve sequenza dello stampo. Lo stampo può quindi essere copiato dalla DNA polimerasi (fig. 13).

 Pertanto, qualora sia nota la sequenza dello stampo da replicare, il punto di inizio della polimerizzazione può essere specificato attraverso un primer che si appai proprio in quel punto. Questo può essere ottenuto per entrambi i filamenti dello stampo con il risultato di indirizzare la DNA polimerasi a sintetizzare una specifica sequenza di DNA (sequenza target) compresa tra una coppia di primer e selezionata fra milioni di altre sequenze. La sequenza viene replicata in modo da aumentarne esponenzialmente il numero di copie.

 La reazione polimerasica a catena è infatti costituita da tre fasi (denaturazione, appaiamento dei primer polimerizzazione o estensione dell'innesco) che vengono ripetute per un numero n di cicli al termine dei quali, teoricamente, il numero di copie della sequenza target è aumentato di 2n.

 Nelle prime applicazioni della reazione, veniva impiegata la DNA polimerasi del batterio Escherichia coli, un enzima sensibile al calore ed inattivato alle temperature richieste per la denaturazione del DNA: era pertanto necessario aggiungere ad ogni ciclo, enzima fresco. Il successo della reazione a catena della polimerasi è dovuto alla purificazione di una DNA polimerasi termostabile dal batterio Thermus aquaticus, capace di vivere in falde idriche molto calde. Tale polimerasi (taq polimerasi) può essere aggiunta alla miscela all'inizio della reazione rimanendo attiva per una serie completa di cicli di amplificazione.

 L'introduzione di tale enzima ha notevolmente semplificato l'esecuzione della reazione, riducendone i tempi e permettendone l'automazione mediante l'impiego di termociclatori, apparecchi che si riscaldano e si raffreddano in modo programmabile.

 Le applicazioni della tecnica sono già molteplici nel campo della genetica, dell'oncologia, della medicina forense, della diagnostica microbiologica.

 L'ampio utilizzo della reazione dipende dal fatto che essa offre una serie di vantaggi. Il ricorso alla PCR, ad esempio, consente di identificare con elevata sensibilità e specificità nonché con brevi tempi di risposta, sequenze virali o batteriche presenti in un campione biologico. A tal fine possono essere utilizzati campioni biologici di varia natura: urine, feci, sangue, liquor, saliva, tessuti bioptici, liquido amniotico, liquido pleurico, materiale citologico, peli, capelli… Non è peraltro necessario che il materiale sia stato prelevato di recente: si può utilizzare anche materiale congelato, incluso in paraffina o parzialmente degradato dal momento che il bersaglio dell'amplificazione è un frammento di dimensioni limitate.

 Un altro vantaggio della reazione a catena della polimerasi è rappresentato dal fatto che sono sufficienti modeste quantità di materiale di partenza: poche gocce di sangue, poche cellule presenti in un tampone, pochi milligrammi di tessuto bioptico…. D'altra parte, il perfezionamento delle metodiche di estrazione, rende ormai possibile il recupero di materiale genomico anche da tracce di campioni biologici consentendo diverse applicazioni in medicina forense. E' noto, infatti, che a ciascun individuo si può attribuire una "carta di identità genetica" grazie all'esistenza di corte sequenze di DNA ripetute in tandem, l'una dopo l'altra, in modo variabile da individuo a individuo.

 La possibilità di decifrare la carta di identità genetica può risultare determinante per la risoluzione di problemi giudiziari quali l'identificazione di responsabili di delitti o attribuzioni di paternità.

 Tramite PCR, ogni "pezzo di genoma" di interesse può essere amplificato in quantità sufficiente per analizzarne in dettaglio la sequenza. In tal modo è stato ad esempio possibile identificare le mutazioni (errori genetici) responsabili di un gran numero di malattie ereditarie quali talassemia, fibrosi cistica, ipercolesterolemia familiare, distrofia muscolare, fenilchetonuria, emofilia…

 In campo oncologico, inoltre, la PCR ha fornito un importante strumento per l'identificazione e la caratterizzazione di elementi genetici quali oncogeni o oncosoppressori importanti nella genesi e nella progressione delle malattie neoplastiche.